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promega 限制性内切酶注意事项(转自promega网站)
来源:技术文章    发布时间:2012-03-24    浏览:1373次
1) 购买的限制性内切酶带有两种不同的酶切缓冲液,该用哪一种?
每种限制性内切酶带有一管酶的zui适反应液(通常是一种4-CORE反应液),可能还带有一只MULTI-CORE反应液。
 
2) 4-CORE酶切缓冲液体系是什么?
大多数(大约75%)Promega公司的限制性内切酶有一种zui适酶切缓冲液,即4-CORE酶切缓冲液,分别叫作A、B、C和D。其余的25%的限制性内切酶带有一种特定的酶切缓冲液(酶切缓冲液E-L)。每一种限制性内切酶带有一只zui适酶切缓冲液。
 
3) MULTI--CORE酶切缓冲液体系是什么?
MULTI--CORE酶切缓冲液适用于双酶切。每一种Promega公司的限制性内切酶都测试了在MULTI--CORE酶切缓冲液中的活力,如果酶切活力达25%,就提供一只MULTI--CORE酶切缓冲液。作双酶切时,如果两个酶在MULTI--CORE酶切缓冲液中的活力达到50-100%,就可替代A-L酶切缓冲液。应选用酶活力zui高的酶切缓冲液。
 
4) 如何保存限制性内切酶?
不太常用的限制性内切酶多保存在-70oC,每周或每天用的酶保存在-20oC。有一些酶需要不同的保存条件。每一种Promega公司的限制性内切酶都提供一份分析说明以供查讯。使用限制性内切酶时,应将酶保存在冰上。
 
5) 一般的限制性内切酶反应中(也叫消化),应用多少内切酶?
所用的酶量取决于DNA的纯度、量和型态。限制性内切酶的活力单位定义为在适当的温度下,在1小时内,1ugDNA在50ul体积中,被完全消化所需的限制性内切酶的量。一般说来,线性DNA比超螺旋DNA更易消化。比如,酶切1uglambdaDNA,需要1-2单位的酶,而酶切1ug质粒DNA,需要3-5单位的酶。
 
6) 使用限制性内切酶的一般步骤是什么?
一般步骤如下:
A)测试酶切DNA的量
B)计算完全酶切所需的酶量。为使终体积中甘油的浓度低于8%,计算能加的酶量,zui多能加终体积的10%(甘油的浓度为5%)。
C)10X反应液的体积应为终体积的1/10;10X反应液的体积不应小于酶的体积。
D)加入计算好的DNA,10X反应液,酶。
加入水到终体积(20-50 ul),轻轻混匀,在适当的温度下保温。一般酶的zui适温度为37 oC,但有例外。应查讯分析说明。
比如:
质粒DNA (2ug/ ul) 5 ul
10X反应液 5 ul
酶(5ug/ ul) 5 ul
dH2O 35 ul
50 ul
37 oC保温2-3小时。
应zui后加酶
 
7) 一次使用两个限制性内切酶的一般步骤是什么(比如双酶切)?
一次使用两个限制性内切酶的一般步骤,如同使用一个限制性内切酶的一般步骤。但要注意两个限制性内切酶在同一种缓冲液中都要有活力。甘油的浓度不应超过终体积的8%。应注意有些酶对末端敏感,活力差。
 
8) 能否在一次反应中用很多的限制性内切酶?
可以,一般而言,甘油浓度超过8%对酶切有抑制。有些酶在高的甘油浓度中会产生星活力。限制性内切酶提供在50%的甘油中,故10 ul反应体积中不应加入超过1.6 ul的酶。
 
9) 消化反应中是否需要加牛血清白蛋白(BSA)?
不需要。酶切不需要加BSA。但Promega公司的限制性内切酶活力测定时,均加入乙酰化的BSA达0.1mg/ml。BSA可以提高许多限制性内切酶活力。Promega公司的限制性内切酶均提供一管乙酰化的BSA(R396D,E,F),并建议酶切时加入BSA达0.1mg/ml。
 
10) 星活力是什么?
星活力是指在保温条件改变,如NaCl过多存在于反应液中,使酶切的核酸序列不同于它特定的识别序列。
 
11) 什么是同切酶?
同切酶指两个酶的识别位点和酶切位点相同,如 Sph I(CGTAC'G)和 Bbu I(CGTAC'G)互为同切酶。
 
12) 什么是neoschizomer?
Neoschizomer指两个酶的识别序列相同,但酶切位点不同,如 Sma I(GGG'CCC)和 Xma I(G'GGCCC)互为neoschizomer。
 
13) 基因组规格指的是什么?
基因组规格的酶适用于酶切包裹在琼脂中的基因组DNA。另外,染色体DNA的制备、酶切和凝胶分离的条件对基因组规格的酶作了优化。
 
14) 如果一个限制性内切酶不是基因组规格,是否表明它不能用于处理染色体DNA?
不一定。如果一个限制性内切酶不是基因组规格,Promega公司没有测试它能否处理包裹的基因组DNA。因此需作一些测试来决定酶是否会切割底物。
 
15) 需要用多少单位的限制性内切酶对琼脂包裹的染色体DNA进行酶切?
切割包裹的DNA比普通底物需要更多的酶,一般需要多2倍
 
16) 什么是蓝/白克隆测试?
蓝/白克隆测试是一种确定酶切样品中,存在的少量外切核酸酶活力的质量检查过程。通过测定一个功能基因(Beta-半乳糖苷酶)酶切和重新连接后,蓝/白斑的比例,来确定外切核酸酶活力。如果存在少量外切核酸酶活力,或不存在外切核酸酶活力,得到的是蓝色菌落。产生粘性末端的酶实验产生的白色菌落应小于2%,而产生平头末端的酶实验产生的白色菌落应小于5%。这个方法的灵敏度很高,可以检测出缺失一个碱基的酶切末端。
 
17) 限制性内切酶是如何命名的?
限制性内切酶命名的次序如下:
A) 用3个字母代表来源的生物(如 Bam 代表 Bacillus amyloliquefaciens
B) 1个字母或阿拉伯数字代表菌株( Bam H)
C) 1个罗马字母代表发现或鉴定的次序( Bam HI)
 
18) 如何稀释限制性内切酶?
如果1小时内会使用限制性内切酶,可用补充有0.5mg/ml BSA的1X反应液稀释,如果在更长的时间内才会使用限制性内切酶,用酶贮存液稀释。
 
19) 如何查讯一种限制性内切酶在特定条件下活力的资料?
请查寻 Restriction Enzyme Properties 。
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