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Nanopore纳米孔测序技术
来源:技术文章    发布时间:2020-02-28    浏览:602次

      纳米孔测序技术如今飞速发展。以Nanopore纳米测序仪为例,它在Nanopore芯片的基质上锚定一个“孔道蛋白”,该蛋白可以和“motor蛋白”结合。“motor蛋白”可以将DNA双螺旋解开成单链,并控制单链通过“孔道蛋白”。当DNA单分子穿过“孔道蛋白”时,不同的碱基会带来不同的电流变化,孔道中的感受器能够感知这种变化。根据电流变化的频谱,应用模式识别算法得到碱基序列
(图1)。

图1 纳米孔测序原理示意图。DNA分子被motor蛋白解螺旋后通过孔道蛋白,产生电流变化。

     仪器特点:
• 实时读取碱基序列,不需要后期集中对测序信号进行二次解读
• DNA/RNA直接测序,RNA不需要经过反转录再测序
• 超长读长,可以达到“M bp”级别
• 高保真度,因为不需要进行PCR扩增,避免了引入突变
• 可以检测碱基修饰
      特点展示1:实时测序
    “Motor蛋白”有两个作用,一个是将捕获的DNA分子进行解螺旋,变成单链分子;另一个是控制单链分子进入纳米孔的速度。当DNA分子上不同的碱基通过纳米孔时,会产生不同的电流变化,这种变化被实时记录下来,然后快速进行数据库检索和匹配,从而解析出对应的碱基类型(图2)。目前的测序速度可以达到,DNA 450bp/秒,RNA 70nt/秒。

图2 纳米孔测序仪对碱基序列的实时解读。

      特点展示2:纳米孔测序直接解读RNA中修饰核苷酸
      传统的rRNA基因或rRNA cDNA拷贝的高通量测序(二代测序,方法是SBS)已广泛用于系统发育研究和临床鉴定传染性生物。然而,通过“边合成边测序(SBS)”的方法移除了rRNA的表观遗传修饰信息。纳米孔测序的一个显著优势,是可对天然DNA和RNA进行直接分析并解析碱基修饰。这种直接RNA测序技术有望快速鉴定环境和患者样本中的微生物。

图3 纳米孔测序仪直接测序RNA。RNA修饰可以作为微生物鉴定的指标,同时纳米孔测序仪的长读长可以帮助提高分类准确性。

      应用领域:
      纳米孔测序仪凭借其超长读长、便捷的建库、实时测序、能进行表观遗传分析等诸多优点,在测序领域逐渐得到广泛的应用。目前,在微生物耐药性/致病性,微生物宏基因组,人类遗传学研究,癌症研究,转录组分析等领域,Nanopore测序仪正带来越来越多的研究成果。
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